大鼠肝微粒體作為體外代謝研究的核心工具，廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、毒理評估等領(lǐng)域。其富含的細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)雖功能強(qiáng)大，但活性易受環(huán)境影響。若操作不當(dāng)，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差甚至失敗。掌握
大鼠肝微粒體在使用中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)，是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、重現(xiàn)性高的前提。
一、規(guī)范儲存，守護(hù)酶活性
大鼠肝微粒體對溫度敏感，應(yīng)始終保存在-80℃超低溫環(huán)境中，避免反復(fù)凍融。反復(fù)解凍會導(dǎo)致酶蛋白變性、活性顯著下降。建議將原液分裝成小份（如50-100μL/管），每次實(shí)驗(yàn)取用一支，解凍后立即使用，嚴(yán)禁再次冷凍。
二、精確配制，確保反應(yīng)體系穩(wěn)定
使用前需將微粒體懸液在冰上緩慢解凍，輕柔渦旋混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致蛋白失活。反應(yīng)體系中微粒體蛋白濃度需精確控制（通常0.1-1.0mg/mL），過高會非特異性結(jié)合底物，過低則代謝信號弱。建議使用預(yù)冷的緩沖液（如磷酸鹽緩沖液，pH7.4）稀釋。
三、優(yōu)化反應(yīng)條件，模擬生理環(huán)境
代謝反應(yīng)需在37℃水浴或溫控?fù)u床中進(jìn)行，確保溫度恒定。啟動(dòng)反應(yīng)前，先將微粒體、緩沖液和底物預(yù)溫育2-3分鐘，再加入NADPH再生系統(tǒng)（提供還原當(dāng)量）啟動(dòng)反應(yīng)。NADPH為關(guān)鍵輔因子，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，避免光照和長時(shí)間暴露于室溫。
四、控制反應(yīng)時(shí)間，避免過度代謝
反應(yīng)時(shí)間需根據(jù)底物代謝速率優(yōu)化，通常為5-60分鐘。時(shí)間過短，代謝產(chǎn)物不足；過長則可能導(dǎo)致產(chǎn)物進(jìn)一步代謝或酶活性衰減。建議進(jìn)行時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)，確保代謝物生成呈線性增長。
五、及時(shí)終止，鎖定代謝狀態(tài)
反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)立即加入終止液（如乙腈、甲醇或含內(nèi)標(biāo)的冷有機(jī)溶劑），使蛋白變性，終止酶促反應(yīng)。延遲終止會導(dǎo)致代謝持續(xù)，影響定量準(zhǔn)確性。
六、注意種屬與批次差異
不同來源、不同批次的微粒體CYP酶表達(dá)水平可能存在差異，建議記錄供應(yīng)商、批號，并在關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)中使用經(jīng)過驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品。若需跨批次比較，應(yīng)進(jìn)行平行對照。
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更新時(shí)間：2025-11-10
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